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E Lectron M icroscopy ciences S Lowicryl Monostep Embedding media SME Catalog # 14335/14345 Si consiglia di ribollimento le MonoSteps per 5 minuti con azoto gassoso prima dell'uso per mescolare bene e per sostituire i gas risolti, che possono impedire la polimerizzazione. Introduzione: Storia di Lowicryl e Sviluppo di Monostep: Inizialmente, bassa temperatura embedding con resine LOWICRYL stato sviluppato per migliorare la conservazione della ultrastruttura cellulare [Kellenberger et al. 1980; Carlemalm et al. 1982], e di immagine sezioni non colorate di materiale biologico nel microscopio elettronico a trasmissione scansione (STEM) [Carlemalm e Kellenberger 1982]. A seconda della composizione effettiva delle resine LOWICRYL, i due tipi di base K4M (polare) e HM20 (non polari) possono essere usati a temperature fino a -35 & deg; C (K4M) o -50 & deg; C (HM20). Exploring cryofixation e congelare-sostituzione portato allo sviluppo di due resine LOWICRYL aggiuntivi, la K11M polare e non polare il HM23 [Carlemalm et al. 1985; Acetarin et al. 1986]. Gli ultimi due resine possono essere usati a temperature fino a -60 & deg; C (K11M) o -80 & deg; C (HM23). E 'stato dimostrato abbastanza presto che a bassa temperatura con la resina embedding LOWICRYL polare (K4M lasciare anche significativamente migliore conservazione della struttura organello e antigenicità [Rothe et al., 1981], rispetto a quella ottenuta dopo fissazione classico e protocolli di incorporamento. Entrambe le resine LOWICRYL polari e non polari sono molto adatti per immunomarcatura e lectina-etichettatura [vedere ad esempio Durrenberger et al, 1991; Roth 1989], spiegando così il loro uso frequente in immunocitochimica sia a livello microscopio ottico ed elettronico. La serie Lowicryl di resine è mista da tre componenti da parte dell'utente. La nuova resina Monostep (polare e non polare) sono stati i successori di queste resine. Tutte le note proprietà di Lowicryls sono stati mantenuti e sono stati aggiunti nuovi Immediatamente applicabili senza mescolare Migliorate proprietà meccaniche Dal momento che le resine Lowicryl sono stati introdotti nel 1980, numerosi articoli hanno riportato risultati ottenuti, grazie all'integrazione di tessuti umani, animali e vegetali, o microrganismi come batteri o lieviti. I protocolli utilizzati erano spesso ottimizzati per soddisfare le esigenze specifiche e, quindi, ampliato dalla minaccia originariamente proposto dal Carlemalm et al. [1982]. A tal fine, i seguenti protocolli possono servire come base per l'incorporamento tessuti animali o microrganismi in Monostep. Fissazione: Buona conservazione delle strutture cellulari e subcellulari generalmente richiede fissaggio dei componenti costituenti. Convenzionalmente, la conservazione fin-strutturale si ottiene il fissaggio chimico. Spesso, i risultati ottenuti con materiale cryofixed sono molto meglio, e allo stesso tempo l'antigenicità dei campioni incorporato è significativamente aumentata. Per ogni oggetto biologico le condizioni precise per il fissaggio (ossia il metodo e, se fissaggio chimico è impiegato, il fissativo (s) utilizzato, la sua / loro concentrazione e tempo di fissaggio) e la dimensione del campione devono essere ottimizzate e possono variare ampiamente tra diversi tipi di campioni. Gli effetti dei diversi fissativi e tempi diversi per il fissaggio sulla conservazione di antigenicità possono essere stimati come descritto da Hortsch et al. [1985] e Roth [1989]. Fissazione chimica: Conventional fissaggio chimico con aldeidi e tetrossido di osmio è effettuata a temperature superiori a 0 & deg; C [Hayat et al. 1981]. Per scopi immunocitochimiche, migliorato la fissazione è stato ottenuto utilizzando soluzioni aldeide tamponate; mentre Glutaraldeide conserva principalmente struttura fine cellulare, formaldeide sembra migliorare la ritenzione del antigenicità. Inoltre, per la successiva disidratazione dal progressivo abbassamento del metodo della temperatura (PLT), fissazione chimica sia con formaldeide o glutaraldeide o-più frequentemente - è richiesta una miscela di entrambi. Dopo tale fissazione chimica e successiva lavorazione a bassa temperatura (disidratazione, infiltrazione di resina, inclusione e polimerizzazione), una grande varietà di esemplari presentano buona conservazione strutturale combinata con elevata reattività immunologica. Con il seguente fissaggio standard per le cellule, abbiamo osservato una buona conservazione dei piccoli dettagli strutturali e antigenicità. Fissaggio viene eseguita per 15-60 min con 0,1-1% (v / v) glutaraldeide in tampone fosfato salino (PBS), o con il 2% (v / v) (v / v) glutaraldeide formaldeide / 0,1% in PBS. Per la fissazione dei tessuti di mammiferi, la perfusione di 10 minuti con il 3% (v / v) di formaldeide / 0,1% (v / v) glutaraldeide in soluzione salina bilanciata di Hank ossigenata è raccomandato [per i dettagli, vedi ad esempio Roth 1989]. Come già accennato, osmio tetrossido di fissaggio deve essere impiegata solo se assolutamente necessario (ad esempio per fissare campioni ricche di lipidi), e se è così, solo a concentrazioni moderate come e. d. 0,1% (w / v) per la successiva - dehydration PLT e Monostep incorporamento, tetrossido di osmio fissazione deve essere interrotta non appena il colore del campione si trasforma in un giallo pallido dal forte UV-assorbimento di un campione impedisce la polimerizzazione UV-indotta . Per una revisione generale sulla fissazione, vedi Bullock [1984]. Per le applicazioni immunocitochimiche, vedere Leenen et al. [1985], Roth [1982 1986 1989] Hobot [1989] (tessuti animali), Schwarz e Humbel [1989] (microrganismi), o Herman [1989] (tessuti vegetali). Cryofixation La stabilizzazione puramente fisico di strutture biologiche da un rapido congelamento è stato chiamato cryofixation. È ormai consolidata che i risultati cryofixation in ottima conservazione di entrambi, l'ultrastruttura dei componenti cellulari nonché l'antigenicità di materiale biologico. Inoltre, cryofixation permette una risoluzione temporale nella gamma msec e consente di intrappolare e visualizzare anche i processi altamente dinamici in cellule e organelli [Knoll et al 1987 in tal modo; Heuser et al, 1978]. Al contrario, a seconda del campione e il protocollo di fissaggio utilizzato, convenzionale fissaggio chimico richiede diversi secondi per minuti. Per molti anni, la maggior parte dei campioni biologici (in particolare tessuti) potrebbero essere cryofixed solo in presenza di crioprotettori come glicerolo o saccarosio per diminuire il tasso di formazione di cristalli di ghiaccio. Tuttavia, l'attuale cryofixation state-of-the-art permette anche la fissazione dei campioni completamente non trattati (sono necessari cioè non crioprotettori e / o fissativi chimici) a pressione ambiente [c. f. Sitte et al. 1987]. La qualità effettiva del materiale cryofixed [per i criteri, vedere Sitte et al. 1987] è limitata dalle proprietà del campione (ad esempio dimensioni di esso, il tasso di trasferimento del calore dal campione al refrigerante), il metodo impiegato (per esempio sbattere o precipitare), e il sistema utilizzato. Con i sistemi di congelamento rapido (cioè tuffo, Slam, o jet freezer), livelli ben conservati di 10-15 & micro; m spessore può essere ottenuto, mentre ad alta pressione congelamento [Moor, 1987; Studer, 1989], può produrre fino a 600 & micro; m strati spessi. Buoni risultati possono anche essere ottenuti in modo riproducibile con un sistema di sbattere freezer "Cryoblock" [Escaig 1982] funzionare a temperature dell'elio luce. Per i campioni cryofixation sono applicati o collegati a piccoli pezzi di carta da filtro o una sigaretta che vengono poi montati su supporti che sbattono [Escaig, 1982]. campioni Cryofixed possono essere conservati per alcuni mesi sotto azoto liquido. Prima di incorporamento a bassa temperatura, sono disidratati per entrambi i freeze-substitioun o liofilizzazione [per la revisione, vedere Plattner e Bachmann, 1982; Robards e Sleytr, 1985; Menco, 1986; Zierold e Steinbrecht, 1987; M & uuml; ller 1988] Disidratazione: Il progressivo abbassamento della temperatura (PTL) Metodo: I campioni biologici che sono stati risolti chimicamente (preferenzialmente utilizzando aldeidi) vengono trasferiti in un agente disidratante, generalmente un solvente organico. Per minimizzare l'estrazione, l'aggregazione, precipitazione, o dislocazione dei componenti cellulari durante la disidratazione, la temperatura viene diminuita gradualmente aumentando nel contempo la concentrazione dell'agente disidratante. Ovviamente è di fondamentale importanza per evitare il campione dal congelamento. Pertanto, la cura deve essere presa per mantenere la temperatura della miscela di disidratazione di sopra del suo punto di congelamento. Inoltre, l'agente disidratante deve essere ben miscibile con la resina utilizzata per il successivo incorporamento. agenti disidratanti che sono stati utilizzati con successo inour laboratorio sono elencate nella Tabella 1. La concentrazione di solvente Dipendenza congelamento Punti: Acetone, theanol e metanolo sono i solventi più comunemente usati per PLT - dehydration. Ad ogni passo del processo di disidratazione, la cura deve essere presa per mantenere la temperatura al di sopra del punto di congelamento della miscela solvente effettiva acquosa. Tabella 1: La polarità e alcuni disidratanti adatti agenti per resine Monostep Durante la disidratazione, il campione deve lentamente e con attenzione essere agitata di volta in volta sia a mano (leggera girevole) o utilizzando un agitatore meccanico (che non deve entrare in contatto con il campione). Importante: I campioni devono essere conservati nella stessa fiala durante l'intera procedura. Qualsiasi esposizione del campione all'aria (condensazione del ghiaccio; essiccazione) deve essere evitato (cioè mentre si cambia l'agente disidratante, il campione viene mantenuto sommerso). L'agente disidratante per la fase successiva del protocollo di disidratazione si deve aggiungere pre-raffreddata in es aliquote di 5 ml. Durante le fasi di disidratazione, le fiale vengono tenuti chiusi da coperchi in polietilene. Dopo disidratazione 100% passo il campione è pronto per l'infiltrazione di resina (vedi infiltrazione). Freeze-Sostituzione La disidratazione dei campioni cryofixed allo stato congelato da solventi organici a temperature comprese tra -80 e deg; C a -90 & deg; C è conosciuta come freeze-sostituzione. L'acqua congelata lentamente scambiare con il solvente circostante (ad es, acetone o metanolo) che può contenere classico agente chimico (s) (ad esempio glutaraldeide, tetrossido di osmio, acetato di uranile, o loro miscele) [Humbel e M & uuml; ller 1986]. La cinetica delle reazioni chimiche tra il fissativo (s) e macromolecole biologiche sono molto lento a queste condizioni [Humbel et al. 1983]. Per esempio, differenze significative nella conservazione dei fini dettagli strutturali sono stati rivelati quando si confrontano sezioni di cellule batteriche dopo freeze-sostituzione per 85 ore sia con acetone puro o 3% glutaraldeide in acetone. Freeze-sostituzione con solventi puri non è certamente una procedura standard e assolutamente richiede una successiva molto bassa temperatura embedding in LOWICRYL K11M o resine HM23 a temperature inferiori a -60 & deg; C [vedi ad esempio Edelmann, 1989; Villiger e Bremer 1990]. I campioni che sono stati cryofixed come descritto (vedi Cryofixation) vengono trasferiti rapidamente da azoto liquido per mezzo di sostituzione. Per applicazioni di routine, 0,56 ml glutaraldeide di una soluzione madre 70% in 13 ml di acetone per campione (concentrazione Glutaraldeide finale: 3% v / v) può essere utilizzato. Gli agenti disidratanti devono essere pre-essiccati utilizzando setaccio molecolare (0.4Nm,). Inoltre, setaccio molecolare può anche essere aggiunto alla fiala contenente il campione durante freeze-sostituzione. Il tempo necessario per freeze-sostituzione dipende dalle proprietà fisico-chimiche (ad esempio polarità, viscosità) del solvente organico usato (per esempio metanolo, etanolo, acetone) e deve essere determinato sperimentalmente. Con microrganismi come batteri, da 80 a 90 ore a -85 & deg; C erano sufficienti per la sostituzione di acetone. Dopo freeze-sostituzione, la temperatura è lentamente (5-10 & deg; C all'ora) portata alla temperatura desiderata per l'infiltrazione di resina (vedi infiltrazione). Per commenti su freeze-sostituzione, vedere Robards e Sleytr [1985], Sitte et al. [1986], Humbel e M & uuml; ller [1986], Steinbrecht e M & uuml; ller [1987]. Liofilizzazione A differenza di congelare-sostituzione, liofilizzazione di campioni biologici seguita da successiva incorporamento a bassa temperatura è stato raramente utilizzato solo nel passato [Wroblewski e Wroblewski, 1986; Chiovetti et al. 1986 1987; Edelmann, 1986; Steinbrecht e M & uuml; ller 1987]. Per la successiva microanalisi a raggi X e analisi citochimica, campioni liofilizzati possono essere bassa temperatura incorporamento sotto vuoto nelle resine Monostep polari o apolari [Wroblewski e Wroblewski 1990] Il Monostep Resine: Cat # 14335 Revisione generale Le resine Monostep a base di acrilato-metacrilato polari e non polari altamente reticolati sono disponibili da microscopia elettronica Sciences (Cat # 14335/14345). kit Monostep vengono spediti pronti per l'uso. L'ossigeno inibisce fortemente la polimerizzazione di metacrilati. Pertanto, miscelazione di Monostep con altri componenti deve essere eseguita in un flusso di gorgogliamento all'azoto. In alternativa, se azoto secco non è disponibile, miscele possono anche essere leggermente agitati manualmente fino a che i componenti sono completamente mescolati. Monostep può essere conservato a 4 & deg; C oa temperature fino a 25 & deg; C. Monostep può agire come sensibilizzante. Il contatto diretto con la pelle deve essere evitato e ben ventilato fumi-cappa dovrebbe essere usato quando possibile. Dal guanti in lattice o in vinile stanno rapidamente penetrati, dovrebbero essere utilizzati solo per pochi minuti prima della sostituzione. Gli esteri acrilati e metacrilati in kit Lowicryl sono potenziali irritanti per la pelle e sensibilizzanti. cura prudente deve essere usato in manipolazione del materiale. Un paio di guanti in neoprene vengono inclusi, ma la cura deve essere utilizzato nel maneggiare il materiale e tutte le cadute sui guanti hanno bisogno di essere ripulito. La scelta definitiva e la cura dei guanti e altri materiali protettivi riposa con l'utente e il suo corretto utilizzo. I guanti devono essere usati se contaminati e sostituito con un nuovo paio adatto di buoni guanti ritardanti chimici scelti dall'operatore sulla base delle sue condizioni di funzionamento. Per l'esposizione più lungo, guanti multi-laminato, ad esempio 4 guanti H, sono raccomandati. Inoltre, una crema mani silicone di protezione può essere utilizzato. resine Monostep sono progettati per la polimerizzazione UV a temperature inferiori a 0 & deg; C. resine Eccezionalmente Monostep possono anche essere polimerizzata ai raggi UV a temperature più elevate (cioè 0 & deg; C a + 30 & deg; C). Per raggiungere questo obiettivo, 0.5% (w / w) benzoinethylether deve essere aggiunto alle resine Monostep. Infiltrazione con Monostep: Dopo disidratazione con il metodo PLT (vedere la sezione Il progressivo abbassamento della temperatura (PLT) Metodo 3.1. Sopra), campioni biologici (cellule coltivate, microrganismi, o piccoli pezzi di tessuto) sono infiltrati dalle resine LOWICRYL come illustrato di seguito. Protocollo per la infiltrazione della Monostep polare e non polare Dopo PLTR-disidratazione: Concentrazione della resina Questo protocollo richiede la presenza di un agente chimico (s) durante freeze-sostituzione. Incorporare e polimerizzazione: Revisione generale: embedding convenzionale e la polimerizzazione viene effettuata a temperature comprese tra 25 e deg; C e 80 & deg; C. Questo non richiede particolari accorgimenti. Migliore conservazione del guscio idratazione delle macromolecole biologiche [Kellenberger, 1987] può essere ottenuta con trattamento a bassa temperatura. È concepibile che questo guscio idratazione gioca un ruolo importante nel determinare l'antigenicità del materiale biologico. Per incorporamento bassa temperatura e la polimerizzazione a temperature comprese fra circa 0 & deg; C a -50 & deg; C, l'uso di congelatori disponibili in commercio è necessario. Il campione viene rapidamente trasferito in 0,5 ml capsule di gelatina (# 1, Lilly Col. Indianapolis IN;.! Solo campione per capsula) che sono pre-riempita con la resina refrigerata da utilizzare. Per minimizzare contaminazioni dovute all'umidità compensatori, una sola capsula deve essere preparato alla volta. Per evitare un riscaldamento della resina, sia un trasferimento del campione e il riempimento della capsula sono eseguite con pipette pre-raffreddata (vetro o polipropilene). Dopo il completo riempimento e la chiusura delle capsule, vengono conservati per circa un'ora al freddo prima di avviare UV-polimerizzazione. polimerizzazione ottimale dovrebbe essere indotta da indiretta (cioè riflessa) UV-irradiazione. Fonti UV di diversi produttori possono essere utilizzati purché il loro massimo di emissioni è vicino alla lunghezza d'onda 360nm. Per ottimizzare il grado e la velocità di polimerizzazione della resina ad una temperatura fissa, il tubo per campionare distanza può essere variata. La velocità di polimerizzazione è corretta se il blocco di resina dopo indurimento non mostra alcuna deformazione o bolle. Esso deve essere tenuto a mente, che la polimerizzazione UV-indotta è efficacemente inibito da campioni che assorbono fortemente leggeri (colore intenso dalla fissazione tetrossido di osmio o pigmenti scuri). Le temperature minime e UV-irradiazione tempo necessario per la polimerizzazione del MonStep Resine: Minima temperatura per polimerizzazione Tempo di UV-irradiazione Dopo polimerizzazione a bassa temperatura blocchi di resina sono stati riscaldati a temperatura ambiente e irradiate per altri tre giorni in UV-luce diretta, per migliorare le proprietà di taglio dei blocchi. Sezionando: Revisione generale: Per ultrasottili sezionamento di campioni Monostep-embedded, coltelli di vetro o di diamante con angoli d'avanguardia di 35-45 & deg; possono essere utilizzati. Ultrasottile sezionamento di blocchi correttamente polimerizzati di resine Monostep non polari può essere eseguita come con resina epossidica-embedded (per esempio EPON 812) campioni. Tuttavia, a causa delle proprietà fisico-chimiche degli acrilati / metacrilati, il contatto tra la resina e il materiale biologico è molto più debole di quella con epossidici. Pertanto, per evitare la deformazione indotta dalla pressione nella zona di esempio, i blocchi non devono essere tagliate a mano, ma tramite un microtomo dotato di una lama di vetro o di un dispositivo di taglio speciale come il Ultratrim (Leica Instruments (Reichert-Jung), Vienna, Austria ). L'angolo di piramide dovrebbe essere di circa il 30 & deg ;, e le superfici della piramide deve essere pulita e lucida. L'ottimale di taglio velocità dipende da vari parametri (ad esempio la dimensione e la forma della piramide, la durezza sia della resina e il materiale biologico incorporamento, la qualità coltello) e solitamente varia tra 2-5mm / s. Le sezioni risultanti vengono depositati sul collodio / carbonio o griglie EM Formvar rivestite. Raccomandazioni per Polar Monostep sezionamento: Si raccomandano le seguenti precauzioni per taglio di campioni che sono incorporati nelle resine Monostep polari; Poiché bagnatura della piramide può provocare una deformazione indotta gonfiore, il livello dell'acqua nella lama-depressione dovrebbe essere ridotto tale da mantenere solo l'avanguardia wettened (scuro reflex grigio). Per ridurre capillare di aspirazione con le facce dei blocchi non perfettamente tagliati, un alto iniziale di taglio velocità di 5-10 mm / s deve essere impiegato. Non appena la superficie piena piramide è il taglio, il taglio-velocità può essere ridotta 2 mm / s. Per evitare la deformazione indotta gonfiore del campione, sezioni Monostep polari devono essere prelevati subito dopo il taglio. Per fornire sufficiente stabilità per ridurre gli effetti di rigonfiamento, lo spessore delle sezioni dovrebbe essere almeno 50 e 70 nm. Solitamente, piramidi deformati o morbido risultato di assorbimento di acqua durante il sezionamento e deve quindi essere immediatamente rimosso dal microtomo ed essiccato sia in un essiccatore o in presenza di un essiccante per almeno un giorno. Trascorso tale termine, il blocco dovrebbe essere appena tagliato. Dopo il sezionamento, i blocchi di resina polari devono essere conservati protetti dall'umidità. La colorazione: Revisione generale: Il generalmente basso contrasto intrinseco del materiale biologico su di imaging nella CTEM chiede il rafforzamento per esempio colorazione con composti di metalli pesanti quali acetato di uranile e citrato di piombo. La procedura per la colorazione dei campioni convenzionalmente incorporati [Lewis e cavaliere, 1974] si applica anche per le sezioni Monostep. Tuttavia, le proprietà fisico-chimiche delle resine Monostep richiedono diversi tempi di colorazione. Utilizzando i dati riportati di seguito, i buoni risultati devono essere ottenuti con campioni Monostep embedded. Protocollo di base per i campioni di colorazione Monostep-embedded: La colorazione Tempo di uranile acetato di piombo acetato o citrato In letteratura vi è una grande varietà di procedure di etichettatura di cui solo una selezione di procedure standard è elencato di seguito. Durante una etichettatura griglie procedura con sezioni sono solitamente incubati per ore soluzioni saline che induce l'ossidazione del rame di griglie standard. Ci sono modi per evitare l'ossidazione. Il più semplice è quello di proteggere le griglie di rame immergendoli in diluito Formvar o collodion prima lamina effettiva è preparato sopra. griglie d'oro può anche sostituire il rame. L'oro è un metallo morbido ed è necessaria abilità dell'operatore per gestire reti oro. Molto diffuso è l'uso di griglie di nichel. Questi sono ferromagnetici e bastone alle normali pinze in acciaio. Questo magnetismo influenza anche la formazione di immagine elettroni in un microscopio in modo che le immagini a basso ingrandimento sono impossibili da eseguire. Anche la correzione dell'astigmatismo per immagini ad alta risoluzione su griglie di nichel è impossibile da eseguire. Fixation è un altro argomento molto discusso in letteratura. Troppo forte (anche aldeide) la fissazione porta ad una ridotta reattività di anticorpi contro l'antigene. Alcuni fissativi come OsO 4 o acetato di uranile coprono l'antigene impedire una reazione con l'anticorpo (tranne durante freeze-sostituzione e criosezionamento). Questi effetti possono essere parzialmente invertito, se necessario, da incisione (OSO 4 o acetato di uranile) o l'incubazione delle sezioni (aldeidi) in HCl diluito (pH 2) prima di etichettatura. Standard Pag Two Step Procedura: Incubare griglie con la faccia sezione per una goccia di 20 mM PBS (pH 7,4) contenente 1% Ovalbumine puro per 5 min a coprire siti di legame non specifici. griglie trasferire direttamente e incubare con la faccia sezione per una goccia di anticorpo primario diluito in PBS 20 mM (pH7.4) contenente 1% puro Ovalbumine per un'ora. Lavare bene con 20 mM PBS (pH 7,4) contenente 1% Ovalbumine puro. Incubare griglie con la faccia sezione per una goccia di diluito anticorpo-oro secondario in 20 mM PBS (pH 7,4) contenente 1% Ovalbumine puro per un'ora. Lavare bene con 20 mM PBS (pH 7,4) Incubare griglie con la faccia sezione a un calo del 1% glutaraldeide in PBS 20 mM (pH 7,4) per 3 minuti. Lavare bene con acqua distillata. La colorazione: Incubare griglie con la faccia parte di un calo del 6% acetato di uranile in H 2 & deg; per 5 a 45 minuti (vedere la sezione colorazione). Lavare bene con acqua distillata. Incubare griglie con la faccia parte di una goccia di acetato di piombo o di citrato di piombo per 45 sec a 3 min (vedere paragrafo colorazione). Lavare bene con acqua distillata. Precoupled singolo Passo Procedura (D & uuml; rrenberger, 1989): Preparare in una provetta Eppendorf un volume totale di 200 & micro; l anticorpo primario diluito in 20 mM PBS (pH 7,4) contenente 1% puro Ovalbumine, contenente 25 & micro; l concentrata 15 nm proteina A-oro (15 & micro; l 10 proteine nm a-vecchio; 10 & micro; l 5 nm proteina a-oro) e incubare per 2 ore a temperatura ambiente. Centrifuga a velocità piena in una tabella di centrifuga Eppendorf. Un pellet difficilmente resuspendable dovrebbe essere formato. Lavare pellet 3 volte con 20 mM PBS (pH 7,4) contenente 1% Ovalbumine puro Aggiungere 400 & micro; L 20 mM PBS (pH 7,4) contenente 1% puro Ovalbumine e metterlo su ghiaccio. Sonicare con 40 kHz (max. 10W) fino leggera di colore rosso (distribuzione colloidale) riappare (in pochi secondi). Evitare la cottura o la formazione di schiuma. Incubare griglie con la faccia sezione per una goccia di 20 mM PBS (pH 7,4) contenente 1% Ovalbumine puro per 5 min a coprire siti di legame non specifici. griglie trasferire direttamente e incubare con la faccia parte di una goccia di anticorpi precoupled appena sonicato 20 mm, PBS (pH 7,4) contenente 1% puro Ovalbumine per il massimo un'ora. Lavare bene con 20 mM PBS (pH 7,4). Incubare griglie con la faccia sezione a un calo del 1% glutaraldeide in PBS 20 mM (pH 7,4) per 3 min. Lavare bene con acqua distillata. La colorazione: Incubare griglie con la faccia sezione a un calo del 6% acetato di uranile in H 2 0 per 5 a 45 min (vedere paragrafo colorazione) Lavare bene con acqua distillata Incubare griglie con la faccia parte di una goccia di acetato di piombo o di citrato di piombo 45 sec a 3 min (vedere paragrafo colorazione). Lavare bene con acqua distillata Diretto oro singolo Fase Procedura: Incubare griglie con la faccia sezione per una goccia di 20 mM PBS (pH 7,4) contenente 1% Ovalbumine puro per 5 min a coprire siti di legame non specifici. griglie trasferire direttamente e incubare con la faccia sezione per una goccia di diluizione anticorpo-oro diretta in 20 mM PBS (pH 7,4) contenente 1% Ovalbumine puro per un'ora. Lavare bene con 20 mM PBS (pH 7,4). Incubare griglie con la faccia sezione a un calo del 1% glutaraldeide in PBS 20 mM (pH 7,4) per 3 min. Lavare bene con acqua distillata. La colorazione: Incubare griglie con il FCE sezione a un calo del 6% acetato di uranile in H2O per 5 a 45 minuti (vedere la sezione di pittura). Lavare bene con acqua distillata. Incubare griglie con la faccia parte di una goccia di acetato di piombo o di citrato di piombo per 45 sec a 3 min (vedere paragrafo colorazione). Lavare bene con acqua distillata. Immunofluorescenza su ultrasottili sezioni: Revisione generale: Ultrasottile methacrylate - (ad es. Monostep polare e non polare) o resina epossidica (Epon / Araldite, Spurr) sezioni vengono trasferiti con un ciclo su rivestito polilisina rotonde coprioggetto. L'acqua residua viene scaricata con carta da filtro lungo la parte esterna del ciclo. Nota: le sezioni in resina con aria secca può essere conservato per mesi prima di etichettatura. Procedura: sezioni segnare con una penna in silicone idrorepellente Incubare sezioni con tampone di bloccaggio, ad esempio PBG (O.2% di gelatina, 0,5% BSA in PBS o TRIS) o 1% latte in polvere in PBS per 10 min. Rimuovere tampone bloccante, aggiungere 25 & micro; l di soluzione di anticorpo primario per coprioggetto (con una concentrazione finale nell'intervallo 1-5 & micro; g specifici IgG / ml) e incubare per 30-60 min. Lavare 5 volte con tampone e incubare con anticorpi secondo fluorocromi marcato, analogo alle condizioni di colorazione anticorpo primario Lavare 5 volte con tampone e contro nuclei macchia con DAPI, Hoechst o ioduro di propidio (0,4-0,1, ug / ml in H2O) per 5 min. Dopo un lavaggio finale con il tampone, montare coprioggetto su vetrini utilizzando una piccola goccia di mezzo di montaggio (Aqua PolyMount o Moviol 4,88) per incorporamento semi-permanente. L'aggiunta di agenti anti-fading come DABC) (25-100 mg / ml), parafenilendiaminico (1 mg / ml) o gallato n-propil (10 mg / ml) è fortemente raccomandato. Utilizzare obiettivi immersione in olio. Attenzione: Tutte le soluzioni devono essere molto pulita o centrifugati prima dell'uso per 2 min a 10.000 rpm in una centrifuga Eppendorf. Ringraziamenti: Vorrei ringraziare il dottor Heinz Schwarz e il Dr. York-Deiter Stierhof dalla Ma-Planck-Institute ofr biologia dello sviluppo, Tubinga (Germania) per il suo contributo di "immunofluorescenza su sezioni ultrasottili" a queste note applicative. Sicurezza: I tipi LOWICRYL sono preparati estere (dologia) acido acrilico. Acidi (todi) acrilici possono causare allergie. I seguenti punti devono essere sempre presi in considerazione quando si lavora con LOWICRYL prodotti: Mantenere l'area in cui si sta lavorando ben ventilata. Usare indumenti protettivi e occhiali protettivi con protezione laterale. Utilizzare creme per la pelle e guanti protettivi adeguati (guanti in lattice non sono completamente protettivo - la protezione può essere limitata a solo pochi minuti) si raccomandano guanti 4H, anche se questi tendono ad andare fragili a temperature molto basse e sono scomodi da lavorare. Evitare il contatto diretto con la pelle del liquido e vapori, utilizzando gli utensili appropriati quali pinzette o altri strumenti meccanici consigliati per tale lavoro. Precauzioni e stoccaggio: La proprietà chimiche, fisiche e tossicologiche di questi prodotti non sono completamente noti. Evitare il contatto con la pelle e gli occhi. Evitare l'inalazione di vapori di resina. Utilizzare cappa ben ventilata per la miscelazione delle resine. E 'stato dimostrato che le resine di metacrilato può causare irritazione alla pelle e occhi e possono causare sensibilizzazione per alcuni individui. Si raccomanda l'uso di utensili e strumenti usa e getta. Nota: I kit non devono essere conservati in frigorifero. In caso di contatto, immediatamente lavare area interessata della pelle con abbondante acqua e sapone. Lavare gli occhi con acqua abbondante. Consultare immediatamente un medico. Dopo la manipolazione, lavare accuratamente. Ordini on-line
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